氮哌酮的危害及檢測(cè)目的
氮哌酮是一種丁酰苯類神經(jīng)安定藥，動(dòng)物使用后可消除緊張感，使其活動(dòng)力下降，對(duì)環(huán)境淡漠并長(zhǎng)期處于安靜狀態(tài)。有助于降低因應(yīng)激及創(chuàng)傷引起的死亡率，因此在長(zhǎng)途運(yùn)輸中常常給豬等動(dòng)物使用該藥。氮哌醇是氮哌酮在動(dòng)物體內(nèi)的代謝產(chǎn)物，與原藥氮哌酮的化學(xué)結(jié)構(gòu)相近，是氮哌酮的殘留標(biāo)示物。通過(guò)食物鏈氮哌酮及其代謝產(chǎn)物氮哌醇會(huì)對(duì)人體產(chǎn)生直接的危害。為此我國(guó)農(nóng)業(yè)農(nóng)村部和國(guó)家市場(chǎng)監(jiān)督管理總局2019年發(fā)布的GB 31650-2019《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品中獸藥最大殘留限量》中明確規(guī)定了氮哌酮及其殘留標(biāo)示物氮哌醇在豬靶組織中的殘留限量。
本文闡述了如何將氮哌酮及其代謝物從樣品基質(zhì)中分離提取出來(lái)，并經(jīng)過(guò)凈化后，轉(zhuǎn)化成高效液相色譜可以檢測(cè)的形式。以提取、凈化為重點(diǎn)，依據(jù)國(guó)標(biāo)GB 29709-2013，為檢測(cè)人員和相關(guān)領(lǐng)域研究人員提供一定的參考。
檢測(cè)項(xiàng)目：氮哌酮、氮哌醇
應(yīng)用范圍：豬的肌肉、皮+脂、肝臟和腎臟
高效液相色譜法
方法原理：試樣中殘留的氮哌酮和氮哌醇用乙腈萃取，正己烷除脂，MCX柱凈化，高效液相色譜測(cè)定，外標(biāo)法定量。
前處理儀器：
分析天平（感量0.01 g 和0.00001 g）；冷凍高速離心機(jī)；氮吹儀；旋渦混合器；固相萃取裝置；超聲波清洗機(jī)；均質(zhì)機(jī)；離心管；濾膜（0.2 μm）。
檢測(cè)儀器：HPLC +PDA
樣品的制備與保存
取新鮮或冷凍空白組織、供試組織，去除筋膜，絞碎，并使均質(zhì)。
取均質(zhì)后的供試樣品，作為供試試料。
取均質(zhì)后的空白樣品，作為空白試料。
取均質(zhì)后的空白樣品，添加適宜濃度的標(biāo)準(zhǔn)工作液，作為空白添加試料。
試料于零下20 ℃ 以下保存。
前處理方法
1.提取
稱取試樣5 g±0.05 g，于離心管中，加乙腈10 mL，旋渦混合1 min，超聲2 min，5000 r/min離心5 min，取上清液，殘?jiān)屑右译?0 mL重復(fù)提取一次，合并兩次上清液。于40 ℃水浴旋轉(zhuǎn)蒸干。用2 %甲酸水溶液5 mL溶解殘余物，加正己烷4 mL，混勻，5000 r/min離心5 min，棄正己烷層液，備用。
2.凈化
MCX柱依次用甲醇3 mL、水3 mL和2 %甲酸水溶液3 mL活化，取備用液過(guò)柱，控制流速小于1 mL/min，用2 %甲酸水3 mL和甲醇3 mL淋洗，抽干，用5 %氨化甲醇4 mL洗脫。收集洗脫液，于40 ℃氮?dú)獯蹈?，用流?dòng)相（乙腈-乙酸銨溶液1+1）1.0 mL溶解殘余物，旋渦混勻，供高效液相色譜法測(cè)定。
國(guó)標(biāo)解讀及注意事項(xiàng)
1.氮哌酮和氮哌醇標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)用甲醇配成1 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，在零下20 ℃ 以下避光保存，有效期3 個(gè)月。
2.本方法使用乙腈兩次提取目標(biāo)化合物，正己烷除脂，陽(yáng)離子交換柱富集凈化，相當(dāng)于5 g試料進(jìn)行上機(jī)檢測(cè)。
3.MCX柱凈化方法為“酸上樣，堿洗脫”。
4.氨水甲醇溶液現(xiàn)用現(xiàn)配，避免氨水揮發(fā)，影響洗脫效果；洗脫過(guò)程中洗脫溶劑少量多次加入，可以增加洗脫率。
5.固相萃取過(guò)程中需要控制流速，使溶液一滴一滴地流下，以保證離子交換的效果。