桿菌肽的危害及檢測(cè)目的
桿菌肽是由一組類似的多肽成分組成的混合物，其中桿菌肽A、B1和B2組分被認(rèn)為最具抗微生物活性。獸醫(yī)臨床上常見(jiàn)以桿菌肽鋅和桿菌肽亞甲基水楊酸鹽形式用于畜禽促生長(zhǎng)和防治動(dòng)物的壞死性腸炎。在歐盟，亞甲基水楊酸桿菌肽還被推薦用于治療由產(chǎn)氣莢膜梭菌引起的兔壞死性腸炎。桿菌肽抗菌譜廣、吸收低，但會(huì)帶來(lái)神經(jīng)毒性和腎毒性，還會(huì)產(chǎn)生抗藥性風(fēng)險(xiǎn)，是治療中使用普通抗生素?zé)o效的最后選擇。若該類抗生素通過(guò)食物鏈進(jìn)入人體，會(huì)對(duì)人體造成健康隱患。因此我國(guó)農(nóng)業(yè)農(nóng)村部和國(guó)家市場(chǎng)監(jiān)督管理總局2019年發(fā)布的GB 31650-2019《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品中獸藥最大殘留限量》中明確規(guī)定了桿菌肽在動(dòng)物靶組織中的殘留限量。
本文闡述了如何將桿菌肽從樣品基質(zhì)中分離提取出來(lái)，并經(jīng)過(guò)凈化后，轉(zhuǎn)化成液質(zhì)聯(lián)用儀可以檢測(cè)的形式。以提取、凈化為重點(diǎn)，依據(jù)國(guó)標(biāo)GB/T 20743-2006，為檢測(cè)人員和相關(guān)領(lǐng)域研究人員提供一定的參考。
檢測(cè)項(xiàng)目：桿菌肽
應(yīng)用范圍：豬肉、豬肝和豬腎
液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜法
方法原理：試樣中桿菌肽殘留用酸化的甲醇水勻漿提取，經(jīng)雙硫腙三氯甲烷溶液進(jìn)行液液分配凈化后，再經(jīng)固相萃取柱凈化，液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀測(cè)定，外標(biāo)法定量。
前處理儀器：
分析天平（感量0.01 g 和0.1 mg）；高速組織搗碎機(jī)（10000 r/min）；振蕩器；離心機(jī)（4000 r/min）；離心管（10 mL和60 mL具塞）；貯液器（50 mL）；固相萃取真空裝置；氮吹儀；微量注射器（25 μL和100 μL）。
檢測(cè)儀器：LC-MS/MS+ESI源
樣品的制備與保存
豬肝臟、腎臟要去除脂肪和其他的非肝臟、腎臟組織，豬肉要去皮和骨頭，將其攪碎拌勻，分出0.5 kg作為試樣，將制備好的試樣密封，并做上標(biāo)記。試樣置于零下18 ℃條件下保存。
前處理方法
1.提取
稱取10 g試樣（精確到0.01 g ）置于60 mL離心管中，加入0.1 mL甲酸和20 mL甲醇+水（1+1），于高速組織搗碎機(jī)上勻漿提取1 min，然后加入20 mL經(jīng)甲醇+水（1+1）飽和的0.0025 %雙硫腙三氯甲烷溶液，于振蕩器上劇烈振蕩10 min，以4000 r/min離心10 min，取上清液10 mL于50 mL試管中，棄去其余上清液。
往上述雙硫腙三氯甲烷溶液中加入30 mL水，搗碎殘?jiān)?，置于振蕩器上劇烈振?0 min，移取全部上清液于另一60 mL離心管中。重復(fù)提取一次，合并上清液，混勻，以4000 r/min離心10 min，取上清液30 mL與50 mL試管中的提取液合并，混勻。
2.凈化
在預(yù)處理過(guò)的固相萃取柱（HLB 60 mg/3 mL用3 mL甲醇和3 mL水活化）頂部連接貯液器，移入上述試管中樣液，待樣液全部通過(guò)萃取柱后，加入2 mL水，棄去全部流出液。然后，將固相萃取柱在50 kPa～55 kPa的負(fù)壓下抽干1 h，最后用2 mL甲醇洗脫，收集洗脫液于10 mL試管中，洗脫液在35 ℃水浴中用氮?dú)獯蹈?，?.5 mL甲醇重新溶解殘?jiān)?，再加?.5 mL 0.3 %甲酸溶液，搖勻后，供液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀測(cè)定。
國(guó)標(biāo)解讀及注意事項(xiàng)
1.桿菌肽標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)用0.1 %甲酸甲醇溶液配成濃度為0.1 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，在2 ℃～4 ℃保存，有效期3個(gè)月。
2.本方法使用酸化甲醇水均質(zhì)提取，經(jīng)雙硫腙三氯甲烷液液分配凈化后，再用HLB固相萃取柱凈化，相當(dāng)于5 g樣品進(jìn)行上機(jī)檢測(cè)。
3.桿菌肽易溶于水，在弱酸性條件下穩(wěn)定，有機(jī)相越高回收率越低，使用酸化甲醇水（1+1）提取回收率高但是容易乳化，使用雙硫腙三氯甲烷進(jìn)行液液分配凈化，離心后可降低乳化程度，使上清液更加清澈。
4.通過(guò)兩次水洗雙硫腙三氯甲烷殘?jiān)?，不僅可提高目標(biāo)物的回收率，確保稀釋倍數(shù)準(zhǔn)確，還可以在合并上清液后降低甲醇比例，為下一步固相萃取凈化做好準(zhǔn)備。
5.固相萃取過(guò)程中需要控制流速，使溶液一滴一滴地流下，以保證凈化富集的效果。
6.本方法使用基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)工作溶液進(jìn)行定量分析，根據(jù)具體檢測(cè)樣品選取合適的基質(zhì)制作空白樣品提取液配制基質(zhì)曲線。