特異性
蛋白酶K具有廣泛的底物特異性。即便存在洗滌劑的情況下，其仍可降解許多非變性狀態(tài)的蛋白質。蛋白酶K分離自一種可在角質上生長的腐生真菌(Tritirachium album)。因此，蛋白酶K能夠降解非變性狀態(tài)的角質（頭發(fā)），因而稱為“蛋白酶K”[1]。其切割的主要位點為帶有封閉氨基基團、鄰近脂族或芳香族氨基酸羧基端的肽鍵。因其廣泛的特異性，其較為常用[2,3,4]。
生理性質
蛋白酶K是穩(wěn)定的S8家族絲氨酸堿性蛋白酶，在鄰近活性位點組氨酸的位置含有兩個二硫鍵和一個游離半胱氨酸[2,4]。
分子量：28,930 Da（氨基酸序列）[21]；28,500 Da (SDS-PAGE)[22]
pH范圍：7.5-12.0（尿素變性后的血紅素為底物），但多數情況下使用的pH范圍為7.5-9.0[2,3]
溫度曲線：最適活性溫度37℃（20至60℃之間活性>最大活性的80%）[3]
pI: 8.92
消光系數：E1%=14.2(280 nm,10mM NaCl和5mM CaCl2，pH8.0[2]
活化劑：活化需要1-5mM Ca2+。去除酶中的鈣離子（加入EDTA）后，會丟失25%的催化活性。但如果通過凝膠過濾去除EDTA-Ca2+復合物，則會總計丟失80%的酶活性，僅在向不含Ca2+的酶中加入過量的Ca2+時，才會發(fā)生少量活化[23]。
蛋白酶K在1% TRITON™ X-100之中激活，并在0.5% (w/v) SDS之中完全激活。SDS和尿素會使蛋白質底物變性，提高消解速率。在這些試劑作用下，蛋白酶K自身的消解速率要慢得多[3,19,20]。
單位定義：在pH7.5、37℃下，每分鐘可水解尿素變性的血紅素，產生1.0mmole (181mg) 酪氨酸所需的酶量為一單位。
抑制劑
蛋白酶K的抑制劑為DIFP或PMSF（后者使用的終濃度為5 mM）[3]。 EDTA只會使其部分失活，并不能起到抑制作用。蛋白酶K不會受到碘乙酸、胰蛋白酶特異性抑制劑TLCK、糜胰蛋白酶特異性抑制劑TPCK以及對-氯汞基苯甲酸鹽抑制。
應用
*線粒體分離
*核酸純化產物的蛋白質消解。在分子生物學應用中，蛋白酶K常用于消解無用的蛋白質，例如從微生物、培養(yǎng)細胞和植物的DNA或RNA制劑中消解核酸酶。[5-11]在核酸制劑之中，這種酶的使用濃度通常為50-200µg/ml，pH7.5-8.0，37℃。孵育時間30分鐘至18小時不等。盡管在長期孵育時，蛋白酶K可以自動消解，但通常還是通過后續(xù)的本分萃取法使其變性[3]
*蛋白酶K已經用于去除陽離子蛋白質上結合的內毒素，如溶菌酶和核糖核酸酶A上的內毒素[12]
*確定酶在膜上的分布[13]
*處理石蠟包埋的組織，以便暴露抗原結合位點進行抗體標記[14]
*去除核酸酶進行原位雜交[15]
*傳染性海綿狀腦病(TSE)朊病毒研究及草擬的診斷測試方法利用蛋白酶K消解來自大腦組織樣本的蛋白質[16,17]
*采用蛋白酶K消解法進行蛋白酶足跡實驗，去除蛋白質-蛋白質表面互作[18]
制備說明
蛋白酶K可溶于水(1mg/ml)，獲得無色透明的溶液。
溶解性和溶液穩(wěn)定性
建議在-20℃下凍存粉末。產品可穩(wěn)定保持至少2年。
蛋白酶K溶液在較廣的pH范圍內（4.0-12.5，最適pH8.0）保持穩(wěn)定，同時在使用時可在25-65℃范圍內保持穩(wěn)定。pH8.0時，溶液至少可在4℃下穩(wěn)定保存12個月[3]。pH4-11.5時，含有Ca2+ (1-6mM)的溶液預計可穩(wěn)定保存數周。80%的硫酸銨懸液可在4℃下至少穩(wěn)定保存12個月[2]。
產品列表
| 產品號 |
產品名稱 |
規(guī)格 |
Cas |
標準包裝 |
| P109033 |
蛋白酶K |
凍干粉，≥30 units/mg protein |
39450-01-6 |
25mg,100mg,500mg,1g,5g,25g,100g |
| P128666 |
蛋白酶K 來源于林伯氏白色念球菌 |
≥20 units/mg dry weight |
39450-01-6 |
25mg,100mg,1g |
| P301575 |
蛋白酶K 來源于林伯氏白色念球菌 |
≥500 units/mL, buffered aqueous glycerol solution |
39450-01-6 |
1ml,5ml,25ml |
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文獻列表
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[22]Bajorath, J., et al., The Enzymatic Efficiency of Proteinase K is Controlled by Calcium. Eur. J. Biochem., 176, 441-447 (1988).
[23]IUBMB Enzyme Nomenclature: http://www.chem.qmul.ac.uk/iubmb/enzyme/EC3/4/21/64.html