黃曲霉毒素的分析方法從最初以薄層層析法為主，發(fā)展到高效液相色譜法、微柱法、酶聯(lián)免疫吸附法等多種普遍應(yīng)用，其進展與新的化學(xué)檢測手段和新儀器的出現(xiàn)密不可分。這些新方法、新手段的快速應(yīng)用，為黃曲霉毒素的檢測分析提供了更廣泛的選擇余地，適應(yīng)了不同的檢測目的和要求。
2.1薄層色譜法(TLC)TLC法是測定黃曲霉毒素的經(jīng)典方法,是我國測定食品及飼料中AFTB1的標(biāo)準(zhǔn)方法之一(GB/T5009.23—1996)[9]。其原理是樣品經(jīng)過提取、柱層析、洗脫、濃縮、薄層板展開分離后,在365nm紫外燈下,AFB1、AFB2、AFG1和AFG2分別顯示紫色、藍(lán)紫色、綠色和綠色熒光。并根據(jù)其在薄層上顯示的最低檢出量來確定其含量。TLC有單向展開法和雙向展開法,其中雙向展開法能進一步除去樣品中的雜質(zhì),提高靈敏度。TLC法由于設(shè)備簡單,易于普及,所以國內(nèi)外仍在使用,但由于該法樣品前處理繁瑣,且提取和凈化效果不夠理想,提取液中雜質(zhì)較多,因而在展開時影響斑點的熒光強度,雙向展開法雖避免了雜質(zhì)干擾,但增加了操作步驟和時間。TLC法較適合于對黃曲霉毒素的定性檢測,是研究黃曲霉毒素初期所使用的主要方法。
該檢測方法所用設(shè)備簡單、費用低廉、容易掌握,適用大量樣品的分離、篩選,一般的實驗室均可開展,屬于定性和半定量檢測。TLC有單向展開和雙向展開法,其中雙向展開法能進一步除去樣品中的雜質(zhì),提高靈敏度,省略了柱層析等凈操作步驟。TLC法由于設(shè)備簡單,一般實驗室都能滿足,利于普及,仍是現(xiàn)在檢測AFT的主要方法之一。Stroka[10]開發(fā)出的光度檢測器在檢測AFT時,最低限可以檢測到1ng。Otta等在TLC上結(jié)合光度計,不僅能把樣品提純,而且也能同時1次對多個樣品進行檢測[11]。江湖等利用HPTLC檢測農(nóng)產(chǎn)品中的AFT,AFB1、AFB2、AFG1、AFG2的檢出限達(dá)0.8、0.4、0.7、0.4μg/kg[12]。王宏亮對國際(3B/T5009·22-1996)所規(guī)定的方法進行了部分改進，在利用CCl4抽提前，加人質(zhì)量分?jǐn)?shù)25%的醋酸鉛溶液和質(zhì)量分?jǐn)?shù)4%的NaCl溶液，再用CCl4振動抽提，于薄層板點樣后展開時，先用CCl4丙酮的混合液正向展開，然后用無水乙醚進行反向展開，回收率為76.9%，最低檢出限量為5×l0-9，改進后的方法進一步排除了蛋白質(zhì)雜質(zhì)，使提取與凈化效果增強，在薄層雙向展開時組分分離也更安全，AFTB1形成的斑點易觀察，操作簡便，但增加了操作步驟[13]?；瘜W(xué)對照品
2.2高效液相色譜法(HPLC)HPLC是近幾年發(fā)展起來的檢測AFTB1方法,主要是用熒光檢測器檢測,在適宜的流動相條件下,采用反相C18柱,使多種黃曲霉毒素同時分離。高效液相色譜法靈敏、分辨率高,可作定性、定量分析,同時可檢測多個黃曲霉毒素種類,適于大批量樣品的分析。
宋歡采用佛羅里硅土凈化柱凈化，三氟乙酸柱前衍生檢測飼料中AFTB1，回收率為83%，相關(guān)系數(shù)r=0.9998[14]。李佐卿等則將免疫學(xué)技術(shù)和HPLC法相結(jié)合,采用免疫親和柱對樣品進行凈化,AFTB1回收率達(dá)到97.3%,相關(guān)系數(shù)r=0.9994,最低檢出限為6.25pg,該法將提取、凈化、濃縮一次完成,大大簡化了前處理過程,提高了工作效率及方法的靈敏度,但增加了成本[15]。文鏡采用國產(chǎn)硅鎂吸附柱層析分離純化玉米中AFTB1,用HPLC法檢測,方法簡便,純化效果好,最低檢出量為0.08ng,回收率為92.87%,該法制柱方便,而且降低了成本[16]。
高效液相色譜法儀器設(shè)備昂貴,技術(shù)水平要求高,每次實驗所使用的化學(xué)藥劑和處理途徑對試驗結(jié)果影響程度差別很大,對實驗結(jié)果的精度造成影響；樣品還需進行繁瑣的純化處理,不適合快速檢測。
2.3微柱法：微柱篩選法是將樣品提取液通過由氧化鋁與硅鎂吸附劑組成的微柱層析管,雜質(zhì)被氧化鋁吸附,黃曲霉毒素被硅鎂吸附劑吸附,在365nm紫外線下呈藍(lán)紫色熒光,其熒光強度在一定范圍內(nèi)與黃曲霉毒素的含量成正比,由于微柱不能分離黃曲霉毒素B1、B2、G1、G2,故檢測結(jié)果為黃曲霉毒素的總量。
微柱篩選法測定黃曲霉毒素,主要是用來檢驗黃曲霉毒素的存在與否以及快速篩選出超標(biāo)樣品。要對黃曲霉毒素種類進行區(qū)分定量檢驗,則需要對不同黃曲霉毒素組分進行分離,再利用其它方法檢測。因此,微柱篩選法并不能完成整個黃曲霉毒素的檢測過程,僅適用于定性檢驗。陳達(dá)民通過微柱法測定黃曲霉毒素,樣品經(jīng)前處理后，即在365nm紫外光下觀察結(jié)果，有微黃色熒光出現(xiàn)，則樣品不含黃曲霉毒素，若藍(lán)紫色熒光出現(xiàn)，則為陽性檢出，再根據(jù)其熒光強度與事先已知含量的黃曲霉毒素標(biāo)準(zhǔn)管相比較確定其含量。
2.4免疫化學(xué)法：免疫化學(xué)法是根據(jù)免疫學(xué)抗原抗體高特異性結(jié)合,設(shè)計并發(fā)展起來的免疫學(xué)檢測技術(shù)[18]。具有重現(xiàn)性好、靈敏度高、選擇性強、特異性強、時間短、檢測限低等特點,同時又能減少有害試劑的使用,對檢測人員健康起一定保護作用,在AFT檢測方面取得了很大的應(yīng)用。具有代表性的主要有免疫層析法(IICA)、放射免疫分析方法(RIA)和酶聯(lián)免疫法(ELISA)等,它們均可以進行定量測定。
2.4.1免疫親和柱熒光光度法(IAC)：IAC是美國公職化學(xué)家協(xié)會(AOAC)檢測AFT的標(biāo)準(zhǔn)方法。其原理是利用單克隆免疫親和柱為分離手段,將單克隆抗體與載體蛋白成功偶聯(lián),偶聯(lián)物填柱形成IAC,并與AFT半抗原產(chǎn)生對應(yīng)的特異性吸附關(guān)系。當(dāng)樣品通過柱子時,因抗原只能吸附相應(yīng)的抗體,所以IAC也就只能吸附AFT,別的雜質(zhì)因不被吸附而流出柱子。IAC的優(yōu)點是在檢測過程中,檢測人員不用直接接觸AFT,并接觸很少試劑就完成整個檢測。操作簡單、耗時短、靈敏度高且能直接讀數(shù),所以應(yīng)用范圍很廣。局限性是不能單獨測AFB1、AFB2、AFG1和AFG2,只能測AFT總量,同時對試劑要求也較高,如檢測過程中所有用到的水必須是雙蒸水,而所用的容器也必須用雙蒸水洗滌。中藥對照品
2.4.2免疫親和柱凈化熒光光度法(SFB)：SFB是新發(fā)展起來的一種檢測AFT的方法,其設(shè)備輕便、自動化高、操作簡單、檢測靈敏、時間短,廣泛應(yīng)用于檢測日常飼料中的AFT是否超標(biāo)。國外Vicam公司開發(fā)出的V2系列型熒光光度計,可以直接讀取AFT的總量。但用SFB法檢測中藥材中AFT的含量時,結(jié)果中出現(xiàn)很多假陽性,造成結(jié)果不準(zhǔn)確。王晶等用SFB法快速檢測日常食用醬油和醋樣品中AFT含量,其檢出限分別是2·5μg/kg和1μg/kg,添加回收率在85%以上
2.4.3酶聯(lián)吸附法(ELISA)ELISA是利用免疫、酶和生化技術(shù)來檢測AFT。ELISA是上世紀(jì)70年代出現(xiàn)的新的免疫技術(shù)[21],最初由荷蘭學(xué)者anWeeman和瑞典學(xué)者Engvall與Perlman幾乎同時提出,主要用于病毒的檢測,70年代中后期開始用于真菌毒素的檢測。ELISA以其簡便、快速、靈敏、成本低、檢測譜廣等特點在檢測方面越來越受到人們的青睞,是一種定性或半定量的方法。
ELISA的基本原理是首先將抗原或抗體固化。吸附在固相載體表面的抗原或抗體,仍然保持著其免疫學(xué)活性。其次是酶標(biāo)記,被固定的抗原或抗體以共價鍵與酶連接形成酶結(jié)合物,而此物仍保持著免疫學(xué)和酶學(xué)活性。三是顯色反應(yīng),酶標(biāo)記物與相應(yīng)的抗原或抗體反應(yīng),再加入底物顯色液,來判定反應(yīng)是否進行,顏色的深淺和免疫反應(yīng)成比例的關(guān)系。所以通過顯色可以判斷反應(yīng)是否進行,而通過后面的測定,又可以進行半定量檢測。ELISA主要分為直接法測定抗原、間接法測定抗體[23,24]、雙抗體夾心法測定抗原、競爭法測定抗原。
2.5金標(biāo)免疫層析檢測技術(shù)(GICA)GICA利用納米金作為標(biāo)記物,在很短的時間內(nèi)就能測出待測物的含量,并可以直接讀取結(jié)果。不需要分離純化樣品,也無需對檢測溶劑做任何的處理,真正做到一步檢測,方便、高效。Zhang等通過此方法分析一個樣品,用時不到10min,非常高效[26]。在金標(biāo)免疫試紙法的應(yīng)用過程中,孫秀蘭等研究了樣品基質(zhì)對試紙條信號靈敏度的影響,并為消除這些影響提供了經(jīng)驗。在檢測樣品中對粗提取液用氯仿法萃取后,使其揮干再溶解,可將鹽離子和重金屬離子對測定的影響控制在允許范圍之內(nèi);用石油醚脫脂,可將油脂對測定結(jié)果的影響降到最低[27]。鄧省亮等用檸檬酸三鈉還原法制備膠體金顆粒,標(biāo)記抗AFB1單克隆抗體并噴于玻璃纖維上,AFB1偶聯(lián)抗原和二抗分別結(jié)合于硝酸纖維膜上,依次將樣本墊、膠金墊、硝酸纖維膜和吸水紙組裝切割成膠體金試紙條并裝入檢測卡中。測試結(jié)果表明,AFB1快速檢測試紙條的靈敏度為5ng/mL,檢測時間為10min,批內(nèi)和批間重復(fù)性100%,假陽性率和假陰性率均為0。
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| 黃曲霉素B2 |
7220-81-7 |
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| 黃曲霉素B1 |
1162-65-8 |
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| 黃曲霉素G1 |
1165-39-5 |
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| 黃曲霉素M2 |
6885-57-0 |
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| 黃曲霉毒素M1 |
6795-23-9 |
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| 黃曲霉毒素G2 |
7241-98-7 |
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黃曲霉素G2 (7aR,10aS)-3,4,7a,9,10,10a-Hexahydro-5-methoxy-1H,12H-furo[3?,2?:4,5]furo[2,3-h]pyrano[3,4-c][1]benzopyran-1,12-dione; Dihydroaflatoxin G1;
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